La qPCR, o PCR en tiempo real, es una técnica de biología molecular que permite amplificar y cuantificar ADN en tiempo real. Esta técnica emplea un termociclador que permite hacer la lectura de la fluorescencia después de cada ciclo de amplificación.

La qPCR incluye ciclos de calentamiento y enfriamiento para generar copias del ADN objetivo. Las copias generadas se detectan mediante el uso de sondas fluorescentes permitiendo así estimar la cantidad de ácido nucleico en la muestra.

Se requieren cebadores específicos para la región de interés, una sonda fluorescente, una enzima polimerasa y nucleótidos para construir nuevas cadenas de ADN. En caso de amplificar ARN, es necesario emplear la enzima retro transcriptasa que convierte el ARN en ADN.

Los cebadores son pequeñas secuencias de ADN diseñadas para hibridar con regiones específicas del ADN que se quieren amplificar. Las sondas son moléculas marcadas con fluoróforos que se utilizan para detectar la amplificación en tiempo real.

Los cebadores (Forward y Reverse) y sondas se diseñan para complementar secuencias específicas del ADN a amplificar. Ambos cebadores deben tener una temperatura de fusión (Tm) similar y no generar estructuras secundarias.

Los kits de PCR VIASURE utilizan sondas TaqMan. Las sondas Taqman son sondas de hidrólisis que están formadas por un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5’ y un desactivador de la fluorescencia o quencher unido en el extremo 3’. Se basan en la actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa. A medida que la Taq sintetiza la nueva cadena de ADN en sentido 5’-3’ degrada la sonda ya hibridada, provocando la liberación del fluoróforo de la sonda, su separación del quencher y la consecuente emisión de fluorescencia.

La Tm es crucial ya que afecta la especificidad de la unión entre cebadores y ADN. Una Tm adecuada asegura una hibridación específica durante la amplificación.

La qPCR incluye controles negativos (sin ADN), controles positivos y controles internos para verificar la calidad de la reacción. En sustitución al control interno, se puede emplear control de extracción.

Los controles negativos garantizan que no haya contaminación y los controles positivos validan el funcionamiento de la reacción.

En los resultados de la PCR en tiempo real se observan las curvas de amplificación dadas por el crecimiento exponencial de las copias del gen (fluorescencia) ubicadas en el eje de las ordenadas versus el número de ciclos de la reacción (Ct) ubicado en el eje de las abscisas.

El umbral de ciclos o Cycle threshold (Ct) es el número de ciclos en el que la señal fluorescente cruza el umbral (threshold) y por tanto se considera que existe amplificación. El Ct es un valor semicuantitativo inversamente relacionado con la cantidad de Ácido nucleico en la muestra, de manera que un número bajo de Ct está relacionado con mayor carga del patógeno y viceversa.

El Threshold es la línea con la cual podemos discernir entre un resultado negativo y un resultado positivo. Todas las curvas que se encuentren por encima de esta línea serán positivas, las que queden por debajo serán negativas.

Es recomendable que se analicen los resultados usando el Threshold automático (calculado por el termociclador), sin embargo, también se puede fijar el Threshold manualmente.  Para ajustarlo correctamente, este tiene que fijar entre un 10 – 20% de la máxima fluorescencia obtenida para cada canal en escala lineal. Se debe ajustar para cada canal y en para cada ensayo individualmente, no se puede establecer un valor fijo:

La fluorescencia basal es aquella que está presente en los primeros ciclos de la reacción. Esta fluorescencia no es causada por una reacción de amplificación, sino que es ocasionada por la química de los reactivos (todas las muestras la contienen, ya sean positivas o negativas).

Se debe eliminar para que la fluorescencia obtenida por todas las muestras en los primeros ciclos sea cero y se puedan analizar correctamente las curvas. De esta manera se fija a partir de que valor la fluorescencia obtenida para cada canal es suficientemente alta como para que se consideres que es una amplificación “real”.

Normalmente, todos los softwares usados para el análisis de resultados fijan automáticamente la Baseline para cada curva de manera individual. Sin embargo, este parámetro también se puede fijar de manera manual en aquellas curvas donde el análisis automático no ha sido satisfactorio. Se recomienda fijarlo entre los primeros ciclos de la curva, desde el ciclo 3 al 15, para eliminar la fluorescencia basal presente en los primeros ciclos de la reacción.

El Background es la fluorescencia inespecífica de la reacción producida por la química de los reactivos. Los equipos de PCR suelen eliminar esta señal automáticamente para mostrar unos resultados claros.

En algunos termocicladores, el canal ROX sirve como referencia interna para normalizar la fluorescencia. Permite corregir las variaciones entre pocillos debidas a imprecisiones en el pipeteo, la posición de los pocillos y las fluctuaciones de fluorescencia.

Los resultados de qPCR se cuantifican calculando una curva standard que relaciona la cantidad de ADN y el valor Ct empleando muestras de concentración conocida.

La eficiencia se calcula a partir de las pendientes de las curvas de amplificación y se usa para determinar cuántas copias de ADN se duplican en cada ciclo.

La calidad y cantidad del ADN/ARN influyen en los resultados. Se deben seguir protocolos adecuados de extracción para asegurar material de partida de alta calidad.

La qPCR es altamente sensible, rápida y cuantitativa. Además, su capacidad para detectar cambios sutiles en la expresión génica la hace esencial en la investigación biológica.

La qPCR multiplex es aquella en la que se amplifican varias secuencias de ADN diferentes simultáneamente pudiendo detectar y diferenciar varios patógenos a la vez. Para ello se utilizan múltiples cebadores y sondas marcadas con diferentes fluoróforos para que puedan diferenciarse en los diferentes canales de lectura. En el caso de los kits de VIASURE los canales utilizados son FAM, HEX, ROX y CY5.